解放军医学院学报

作者：张璇, 王辰, 杨琳, 段霏, 杨燕美, 顾斌

关键词：牙周膜干细胞, 炎症, Wnt通路, 成骨分化, 增殖

  背景  慢性炎症环境下人牙周膜干细胞 (human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)生物学功能受损是牙周炎患者组织再生治疗困难的关键原因。作为非经典 Wnt/Ca2+信号通路的分泌型配体，Wnt5a在干细胞生长发育及炎症性疾病中发挥着关键作用，但炎症微环境下 Wnt5a 对hPDLSCs增殖和成骨分化的影响尚不明确。  目的  探讨炎症微环境下过表达Wnt5a对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化能力的影响。  方法  收集健康离体牙，参照酶消化法分离培养原代hPDLSCs。使用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激hPDLSCs，构建体外炎症微环境。按照阴性对照组、过表达组、TNF-α + 阴性对照组、TNF-α + 过表达组进行实验分组。成骨诱导条件下实时定量PCR检测炎症因子白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、TNF-α、成骨关键基因Runt相关转录因子2(recombinant runt related transcription factor 2，RUNX2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、Ⅰ型胶原(collagen-1，COL-1)和Wnt5a 信号分子的mRNA表达变化；利用慢病毒转染技术获取过表达Wnt5a的hPDLSCs；CCK-8 法测定Wnt5a对hPDLSCs增殖的影响；成骨诱导培养后，ALP染色、茜素红S(alizarin red S，ARS)染色用于评价过表达Wnt5a对hPDLSCs成骨分化能力的影响，实时定量PCR和Western blot法检测过表达Wnt5a后hPDLSCs中成骨标志物RUNX2和COL-1的mRNA及蛋白表达水平。  结果  与正常组相比，炎症组中IL-1β、IL-6、TNF-α及Wnt5a的mRNA表达增加(P均＜0.01)，而成骨相关基因RUNX2 (P=0.031)、ALP (P＜0.01)、COL-1 (P=0.014)的mRNA表达下降；慢病毒感染48 h后在荧光显微镜下观察到细胞呈GFP绿色荧光，与阴性对照组相比，过表达组中Wnt5a的mRNA及蛋白表达量显著增加 (P均＜0.01)；CCK-8结果表明过表达组细胞活力较阴性对照组增强(P＜0.01)，但TNF-α + 过表达组与TNF-α + 阴性对照组相比，细胞增殖活力下降(P＜0.01)；成骨诱导条件下，过表达组中成骨早期标志物COL-1、RUNX2的mRNA (P均＜0.01)和蛋白(P均＜0.01)表达水平及钙结节形成量降低；但在炎症微环境下，与TNF-α + 阴性对照组相比，TNF-α + 过表达组中COL-1和RUNX2的mRNA (P=0.022；P=0.016)和蛋白(P均＜0.01)表达水平升高，ARS染色显示其着色深度及钙结节形成量增加，ALP染色显示细胞体外矿化能力增强。  结论  炎症微环境下hPDLSCs中Wnt5a表达上调。正常培养条件下过表达Wnt5a后，hPDLSCs增殖能力增强、骨向分化能力降低。但在 TNF-α 刺激的炎症微环境下，过表达Wnt5a抑制hPDLSCs增殖、促进hPDLSCs成骨分化。慢性牙周炎过程中，hPDLSCs可能通过Wnt5a非经典通路调节成骨和增殖过程。

来源：2023年第9期

《解放军医学院学报》期刊编辑部

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